[VIP第1年] 指数:3
比较Ct值的相对定量法：此方法是将待测靶基因片段和内参照基因片段同时扩增，可以在两个反应管中或者一个反应管中进行扩增反应，并且就两者的ct值之差进行测量，上海转基因荧光定量PCR分析服务。在采用此方法过程中需要用数学公式进行相对量的计算，首先要假设每个循环产物增加一倍时PCR反应**期得到Ct值对起始模板的量一个循环的估算和起始模板数两倍相当，上海转基因荧光定量PCR分析服务。这种方法的前提是靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致，上海转基因荧光定量PCR分析服务，所以在应用过程中效率的偏移会对实际拷贝数估计产生一定影响，因此，为了保证目的基因和内参基因的扩增效率相等应当加强对反应体系的优化，这也是该方法应用的难点之一
使用可高压处理的移液器，由于移液器容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染，因此要使用可高压处理的移液器 。严格按照试验的分区进行操作，按照提取区、扩增区、检测区单方向流动，物品、样品和试剂不可逆向流动 。操作多份样品时，制备反应混合液，先将荧光 PCR 反应液、荧光探针和酶混合好，然后分装到每个 PCR 管中，这样即可以减少操作次数，避免污染，又可以增加反应的精确度 。加样品、加蛋白酶 K 和加样品过程中，特别注意防止样品的交叉污染和酶的降解 。操作时设立阴性及阳性对照，可验证荧光 PCR反应的准确性和可信性
RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用***反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
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