在实时荧光PCR中,江苏转基因荧光定量PCR分析服务,江苏转基因荧光定量PCR分析服务,江苏转基因荧光定量PCR分析服务。模板的定量有2种方法:***定量和相对定量。***定量一般通过已知的标准曲线来确定我们所感兴趣基因的拷贝数;相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化
相对定量:相对定量法又分为两种
比较标准曲线的相对定量法:在一定样本中,靶序列相对于另一参照样本量变化情况进行分析的方法为相对定量法。在采用该方法过程中,需要有参照物,所以较容易绘制定量标准曲线,只要将标准品稀释度确定便可进行对比分析
***定量:用已知的标准曲线对未知样本的量进行推算的方法为***定量法。此种方法需要明确标准样品的浓度情况,然后稀释标准样品,分为几个不同梯度浓度然后进行反应测试。横坐标为标准品拷贝数的对数值,纵坐标为测得的Ct值,进而绘制出标准曲线。以标准曲线为基础,在定量分析未知样品过程中根据其ct值能够将样起始拷贝数推算出
实时荧光定量PCR技术总结为以下几点。特异性强 灵敏度高 重复性好 检测速度快 自动化程度高
实时荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性高和精确性高的优点,此项技术已被应用于分子生物学、医学、食品检测和环境监测等多个领域
浓度测定
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495μl的TE中,测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 μl,剩余RNA总量为:
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
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